卡梅德生物技术快报｜抗体纯化：双抗抗体纯化工艺开发：复合模式层析参数优化与 DoE 应用实践
0 前言
双特异性抗体下游开发中，抗体纯化是连接上游表达与终产品的核心环节，聚集体与宿主残留去除是工艺难点。本文基于复合模式层析技术，结合实验设计（DoE）方法，完整复现对称型 IgG‑like 双抗抗体纯化工艺开发流程，包含填料筛选、参数优化、条件验证全步骤，提供可直接复用的技术方案。
1 工艺痛点与技术选型
双抗分子结构复杂，易形成 HHLLL、HHLLLL 等聚集体，常规阴离子交换层析去除有限，且 HCP、DNA 残留控制难度大。复合模式层析集成阴离子交换与疏水作用，高选择性适配复杂杂质体系，成为抗体纯化抛光阶段优选技术。
2 材料与方法
2.1 样品与填料
目标蛋白：对称型 PD‑L1×TIGIT 双抗，CHO‑S 细胞表达；填料筛选：Capto adhere ImpRes、EzSreen Diamond MIX‑A 等 4 款阴离子 / 疏水复合填料；设备：AKTA Avant 150、e2695 液相色谱仪、实时荧光定量 PCR 仪。
2.2 纯化流程
三步层析工艺：
- Protein A 亲和层析：中性结合、酸性洗脱，捕获目标抗体；
- 阳离子交换层析：去除部分聚集体与杂质；
- 复合模式层析：流穿模式，深度去除聚集体、HCP、DNA。
2.3 DoE 优化设计
采用中心复合设计（CCD），考察上样 / 平衡液 pH（5.5–7.5）、电导（15–35 mS/cm）对纯度、回收率、HCP 残留的影响，Minitab 2017 进行数据分析。
3 关键参数优化结果
3.1 填料筛选
40–75 μm 粒径填料聚集体去除效果优异，EzSreen Diamond MIX‑A（75 μm）兼顾去除效率与工业化适配性，HCP 清除率≈95%。
3.2 pH 与电导优化
最优条件：pH 6.3±0.2、电导 20±2 mS/cm，回收率≥90%，HCP 残留≤50 ppm，SEC‑HPLC 纯度＞98%。
3.3 保留时间与载量
保留时间≥5 min，聚集体去除效果稳定；载量 40–80 mg/mL 填料，纯度＞99%，80 mg/mL 时回收率最高（97.80%）。
3.4 收集节点优化
聚集体富集于峰后端（20% 峰高以下），确定 500 mAU 开始收集，20% 峰高截止，保障纯度与收率。
4 验证结果
抗体纯化终产品：SEC‑HPLC 纯度＞99%，HCP＜20 ppm，DNA 低于检测下限，聚集体去除≈7%，回收率＞93%。
5 总结
复合模式层析结合 DoE 优化，实现双抗抗体纯化高效可控，工艺简洁、易放大、无额外添加剂，为复杂抗体分子下游开发提供标准化路径。
参考文献：魏利，刘道琴，于雪莲等。复合模式层析在双特异性抗体纯化工艺开发中的应用 [J]. 中国生物制品学杂志，2025,38 (8):951‑961.