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JACS｜AlphaFold3发现共价配体

news 2026/8/20 4:18:55

摘要

共价抑制剂是研究和治疗工具中的重要模态，但共价配体发现的计算方法匮乏，阻碍了该领域的发展。AlphaFold3（AF3）等人工智能模型在配体构象预测方面表现出准确性，但其在虚拟筛选中的适用性尚未得到评估。本研究表明，AF3共折叠预测及其相关预测置信度指标，在区分真实共价结合物与性质匹配的诱饵分子时达到近最优分类效果，在１组蛋白激酶靶点上的表现显著优于最先进的共价对接工具。在针对模型激酶BTK的前瞻性虚拟筛选中，发现了１种化学结构独特的新型共价小分子，该分子在体外和细胞内均表现出强效抑制活性，同时具有显著的激酶组和蛋白质组选择性。共结晶实验验证了AF3预测结合模式的亚埃级准确性。这些结果表明，AF3可实际用于激酶（药物靶点中最多产的家族之一）的新型化学实体发现。

nir.london@weizmann.ac.il

#AlphaFold3 #共价抑制剂 #虚拟筛选 #共价配体 #蛋白激酶 #结合模式预测 #mPAE #COValid基准集

结果

COValid支持共价对接算法的优化与对比

图1COValid支持共价对接算法的优化

(A) COValid集的组成。

(B) 诱饵设计方案：从共价「活性分子」中移除亲电试剂（E），随后为所有活性分子收集性质匹配、拓扑结构不同的非共价诱饵；最后，通过将丙烯酰胺连接到非共价诱饵的游离胺上，为每个活性前体匹配36-50个诱饵前体，并确保与活性分子的性质匹配。

(D) 利用COValid进行参数优化的示例：DOCKovalent的角度范围参数定义了用户指定角度（109.5°）周围的范围Δ，以便在对接过程中对２个键角（由半胱氨酸Cβ、Sγ和丙烯酰胺Cβ原子定义的角度a，以及由半胱氨酸Sγ、丙烯酰胺Cβ和Cα原子定义的角度b）进行±Δ采样；±5°采样以及进一步的±10°采样可显著提高平均调整LogAUC（p值分别为0.0002和0.004），但将穷尽性进一步提高至Δ=20°并未带来显著改善（p值：0.1053），同时需要显著更长的运行时间。

(E) ３种共价对接工具的最佳识别配置在10个共价PDB结构上的富集效果对比。

AlphaFold3最小预测对齐误差是虚拟筛选富集的优质指标

图2利用AF3 mPAE实现抑制剂的近最优富集

(A) AF3准确预测共价复合物的示例（K-Ras G12C与Mg²⁺和GDP结合，PDB：7070，口袋对齐RMSD=0.45 Å），该结构未包含在训练集中（实验结构与AF3预测模型的数据均来自AF3的数据分析步骤；非共价配体以DUDE-Z的SMILES字符串形式提供）。

(B) ２种最佳基于物理的共价对接工具与AF3基于结构预测（按mPAE排序）的富集效果对比（灰色和紫色分别表示对接工具和AF3）。

(D) AF3 mPAE在DUDE-Z靶点上的富集性能：在所有43个DUDE-Z靶点中，对比AF3预测（按mPAE排序）与DOCK3.7和DOCK6.9报告结果的富集效果。

表1 COValid集上的性能表现

共价前瞻性筛选发现新型激酶抑制剂

图3前瞻性筛选发现的新型BTK抑制剂的实验表征

(A) 13种合成化合物的完整蛋白质LC-MS共价标记百分比（1 μM BTK，200 μM化合物，pH 7.5，室温，孵育2小时）；n=2，数据以平均值±标准差表示。

(B) BTK与YS1孵育后的解卷积LC/MS光谱：质量差异对应配体加合物，验证了共价结合。

(D) 主要靶点化合物与依鲁替尼的LC/MS剂量反应标记实验（1 μM BTK，pH 7.5，室温，孵育 2小时）。

(E) LC/MS时间进程实验（1 μM BTK，5 μM化合物，室温，pH 7.5）；n=2，数据以平均值±标准差表示。

(F) 谷胱甘肽（GSH）反应性评估实验（5 mM GSH，0.2 mM化合物，pH 8，25 °C）。

(G) 差示扫描荧光法（DSF）分析化合物处理后BTK熔点的变化（5 μM BTK激酶结构域，0.02 mM化合物，pH 7.5，25 °C孵育过夜）；通过每个数据集中最小值的绝对值归一化导数报告器来确定熔点；依鲁替尼、YS1、YS2和YS3分别使BTK的熔点稳定升高约13 °C、9 °C、5 °C和1 °C；BTK基线曲线以黑色绘制。

(H) 放射性滤膜结合实验进行激酶抑制分析，测定磷酸化底物产物（20 μM ATP，3 nM BTK，0.2 mg/mL pEY底物，pH 7.5，室温）；YS1、YS2和YS3的IC₅₀分别为30 nM、77 μM和8.4 μM。

(I) YS1对362种激酶的抑制数据对应的激酶系统发育树：每个测试激酶用１个点表示；点的大小与300 nM YS1剂量下相对于DMSO的平均抑制百分比相关；平均抑制率大于40%的点标记为红色，否则为绿色。

(J) Mino细胞中BTK活性的剂量依赖性实验，通过BTK自磷酸化测定：细胞与DMSO或不同浓度的YS1孵育1小时，用抗IgM激活细胞，通过蛋白质印迹法定量BTK自磷酸化并相对于总BTK归一化；IC₅₀（170 nM）通过Prism软件将数据拟合到剂量反应曲线计算得出（n=3）。

(K) 通过与依鲁替尼的炔基探针类似物Probe 4（左）和通用激酶探针XO44（右）的竞争性下拉实验定量YS1的选择性：Mino细胞用DMSO或1 μM YS1处理1小时，随后用1 μM Probe 4或2 μM XO44处理45分钟（n=4）；采用无标记定量法对蛋白质进行定量；右上象限的蛋白质显示显著变化（倍数变化>2；p值<0.01）；在Probe 4实验中，共绘制3416种蛋白质（159种激酶和3257种非激酶），其中11种表现出显著竞争性结合（2种激酶和9种非激酶）；在XO44实验中，共绘制3569种蛋白质（235种激酶和3334种非激酶），其中5种表现出显著竞争性结合（3种激酶和2种非激酶）；激酶通过KinHub的人类激酶UniProt条目列表确定。

图4AF3结构预测具有高准确性

AF3预测结果（蓝色）与YS1（A）和YS2（B）共价结合到WT-BTK激酶结构域Cys481上的X射线晶体学实验结果（灰色）的叠加图；为清晰起见，还分别显示了预测配体构象与实验确定的配体结构的叠加；配体重原子RMSD值分别为0.50 Å和0.41 Å；每个配体在BTK活性位点的特写视图标注了相互作用残基；虚线表示推定的氢键。