bulk RNA-seq之后，为什么还需要组织原位空间蛋白组观察？

在肿瘤微环境研究中，bulk RNA-seq因其高通量、低成本的优势，常被用于初步筛选差异表达基因和通路。然而，bulk测序将整块组织的RNA混合分析，得到的是"平均信号"——研究者可以知道某个基因在组织中整体高表达或低表达，但无法知道这些表达信号来自哪些细胞、分布在组织的什么位置、与周围细胞形成什么关系。当bulk分析提示了有趣的候选通路或细胞类型后，如何进一步在组织原位层面深化理解，是许多课题组面临的实际问题。

近期发表在Science Advances的一项研究为非小细胞肺癌（NSCLC）组织微环境分析提供了值得参考的技术路径。该研究纳入132例患者样本，对其中122例进行了bulk RNA-seq分析，同时对50例进行了基于PhenoCycler平台的超多重免疫荧光成像，使用33抗体panel在组织原位对150万个细胞进行了蛋白表达和空间定位分析。研究通过bulk RNA-seq的反卷积分析估计了免疫细胞类型比例，发现不同研究分组中存在细胞组成差异；但这些bulk层面的发现，无法回答"这些细胞在组织中位于哪里、是否表达关键功能蛋白、与哪些细胞形成邻近关系"等问题。

这正是组织原位空间蛋白组学可以补充的维度。PhenoCycler-Fusion（PCF）作为一种超多重蛋白成像技术，可以在同一张组织切片上同时检测数十种蛋白标志物，实现单细胞分辨率的蛋白表达定量。在上述研究中，研究者通过33抗体panel不仅鉴定了13种细胞类型，还观察了多种功能状态标志物——包括免疫检查点（PD-1、PD-L1、ICOS、LAG3）、细胞毒性标志物（Granzyme B）、增殖标志物（Ki67）、抗原呈递分子（HLA-DR、HLA-A）以及代谢酶（IDO1）等。这些蛋白层面的信息，是bulk RNA-seq难以直接提供的。例如，bulk数据可能提示某样本中CD8 T细胞相关基因表达较高，但PCF可以进一步观察这些细胞是否表达Granzyme B（提示杀伤活性）、是否表达PD-1（提示耗竭相关状态）、是否与树突状细胞形成空间邻域。

从科研设计角度考虑，当bulk RNA-seq已经提供了候选细胞类型和通路线索后，下一步不一定必须做空间转录组。如果研究问题的核心是"这些细胞在组织中处于什么状态、表达什么蛋白、与哪些细胞相邻"，PCF可以作为更直接的路径——它不需要额外的转录组探索，而是直接将bulk分析提示的候选marker转化为抗体panel，在组织原位进行蛋白层观察。这种"bulk发现→PCF原位观察"的路径，特别适合样本量有限、以FFPE样本为主、研究问题聚焦蛋白标志物和细胞状态的科研场景。

该文献的研究设计提示，bulk RNA-seq与PCF的联合可以形成"转录层筛选→蛋白层空间观察"的研究框架。bulk数据帮助研究者从整体上识别值得关注的基因表达差异和细胞组成变化；PCF则把这些线索带回组织切片中，从单细胞分辨率观察蛋白表达、细胞身份、功能状态和空间邻域关系。对于复杂组织微环境研究而言，这种联合策略有助于从"平均信号"走向"空间细节"，为后续机制假设和实验设计提供更具体的组织层线索。

【说明】

本文仅为科研技术方法介绍，不涉及疾病诊断、治疗建议、疗效预测、用药指导或临床决策。文中提及的研究发现均来自学术文献，相关分析结果需结合更多实验和研究进一步验证，不构成任何医疗意见。

【参考文献】

Zheng Y, Sadée C, Ozawa M, Howitt BE, Gevaert O. Single-cell multimodal analysis reveals tumor microenvironment predictive of treatment response in non-small cell lung cancer.Sci Adv. 2025;11(21):eadu2151.