卡梅德生物技术快报｜基于真核表达系统产物，双步层析法高效纯化 rD-M 融合蛋白工艺落地
一、提出问题
毕赤酵母真核表达系统发酵上清液成分复杂，包含菌体代谢杂蛋白、多糖、小分子多肽、无机盐等杂质，直接使用粗提液无法满足体外活性评价标准。传统单一离子交换或分子筛纯化，普遍存在两个痛点：单一层析只能去除部分杂质，最终产物纯度不足 75%；纯化收率偏低，大量目标蛋白在层析挂柱、洗脱环节流失，经过真核表达系统获得的发酵原液白白损耗，提高原料生产成本。针对 rD-M 融合蛋白理化特性（等电点偏碱性、分子量约 12kDa），需要组合两步层析技术，搭建从粗上清到高纯蛋白的标准化纯化路线，解决纯度与收率双向难题。
二、分析问题
- 杂质特性分化：发酵杂蛋白分为阴离子型杂蛋白（可被 Q 阴离子柱吸附）、小分子杂肽（分子量远低于 12kDa，分子筛可分离），单一层析无法同时去除两类杂质；
- 缓冲液体系适配：pH、盐浓度变化会改变目的蛋白带电性，直接影响 Q 柱挂柱效率，进而降低真核表达系统产物纯化回收率；
- 分子筛参数：Sephadex G-75 分子筛分离区间适配 3kDa~70kDa，恰好适配 rD-M 分子量，但若流速不合理，蛋白峰与杂峰重叠，分离效果下降。 基于以上理化分析，确定「Q Sepharose HP 阴离子交换层析→Sephadex G-75 凝胶过滤层析」的两步串联纯化方案。
三、解决问题（双步层析实操方案）
第一步：Q Sepharose HP 阴离子交换层析（粗纯化）
- 平衡：20mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡层析柱 3 倍柱体积；
- 上样：发酵上清过滤后匀速上柱，同平衡液冲洗 3~5 柱体积去除流穿杂蛋白；
- 梯度洗脱：含 1mol/L NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液线性洗脱，收集蛋白洗脱峰，SDS-PAGE 筛选含目标蛋白组分。
第二步：Sephadex G-75 分子筛精细纯化
Q 柱富集样品浓缩后上样 G-75 凝胶柱，磷酸钠缓冲液 1.0mL/min 匀速洗脱，分段收集洗脱组分，电泳筛选高纯目的蛋白，冻干保存。 全程依托真核表达系统获得的标准化发酵原液做原料，所有缓冲液、流速参数固定化，保证工艺可重复。
四、直观实验数据
- Q 柱粗纯结果：粗上清经阴离子柱纯化后，蛋白纯度由原液 12% 提升至 68%，目标蛋白收率 65%；
- G75 精细纯化数据：分子筛二次纯化后终产物纯度＞95%，整体工艺综合收率 43%；
- 重复性验证：连续 3 批次真核表达系统发酵产物纯化，最终纯度波动＜3%，工艺稳定性达标； 高纯冻干蛋白满足后续细胞水平活性筛选实验需求。
文末参考文献
朱文赫，张巍，徐俊杰等.rSalmosin-Mel 融合蛋白在毕赤酵母中表达及活性研究 [J]. 生物技术，2017,27 (3):239-243.