【一手数据】犬髓核细胞(NPC)原代细胞Primary Canine Nucleus Pulposus Cells 分离培养和鉴定

犬髓核细胞(NPC)原代细胞 Primary Canine Nucleus Pulposus Cells (NPC)

品系：beagle Dog比格犬

组织来源：椎间盘髓核

鉴定：II型胶原（Collagen II）免疫荧光染色，聚集蛋白聚糖（Aggrecan）免疫荧光染色等，阳性率纯度>90%

说一说分离和培养方案：

一：椎间盘取材 将犬只仰卧位固定，暴露腹主动脉旁脊柱，通常取L1-L4或L5-L7段。用咬骨钳小心咬除椎体前缘骨皮质，显露椎间盘及髓核腔隙。 用精细眼科镊和刀片小心分离椎间盘纤维环，可见中央半透明胶冻样髓核组织（正常犬髓核呈乳白色或淡黄色，质地粘稠）。以无菌镊夹取髓核组织块（每个椎间盘约20～50 mg），置于含双抗PBS的50 mL离心管中。

二：组织预处理和酶联合消化 将髓核组织在含双抗PBS中漂洗2～3次，用眼科剪小心剔除附着的软骨终板及纤维环组织。 将清洗干净的髓核组织转移至新的培养皿中，剪成约1 mm³的小组织块。 将剪碎的髓核组织转移至50 mL离心管中，加入5～10倍体积的0.1%～0.2% II型胶原酶（溶于无血清DMEM/F12培养基），37℃水浴或恒温摇床中消化3～4小时，每30～40分钟轻轻摇晃一次。消化完成后，将悬液通过70 μm细胞筛过滤，去除未消化的组织残渣。 收集滤液，1000 rpm离心5～8分钟，弃上清。 用含10% FBS的完全培养基重悬细胞沉淀，再次离心洗涤1次。

三：细胞接种和培养 弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，细胞计数后以适当密度接种至T25培养瓶（通常每个T25瓶接种1～2个椎间盘分离的细胞量）。 于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养。 细胞生长观察 接种后24～48 h：大部分细胞已贴壁，细胞呈圆形或多边形。 接种后3～5 d：细胞逐渐伸展呈短梭形或三角形，开始增殖形成小集落。 接种后7～10 d：细胞集落逐渐扩大，融合度可达70%～80%，此时可传代。

Fig. Morphology of Canine Nucleus Pulposus Cells (×100)

四、免疫荧光鉴定
检测特征蛋白表达：
高表达标志物：聚集蛋白聚糖 ACAN、Ⅱ 型胶原 COL2A1、PAX1、CD56 (NCAM)、波形蛋白 Vimentin、角蛋白 CK18

Fig. Immunofluorescence identification of COL2A1 (×400)

Fig. Immunofluorescence identification of Vimentin (×400)

武汉云克隆有近二十年的原代细胞研发经验，依托GMP级细胞制备平台与专业技术团队不仅构建了丰富来自大、小鼠，兔，犬，猫，山羊，豚鼠等540多种动物源原代细胞产品体系。更打造了从实验设计、细胞选型、培养操作到数据解读的全链条技术支持服务。