交大医学院 | VHL综合征家系致病基因研究克服WES/芯片检测小片段CNV的技术缺陷
标题：使用MLPA-NGS技术鉴定 Von Hippel-Lindau 综合征家系中的VHL胚系缺失
作者: Yang Y, Ren X, Xia C, Zhang Y, Song X, Tang X, Du C, Xu W, Weng W. 上海交通大学医学院 上海儿童医院临床检验科；上海交通大学药学院 儿科感染、免疫与危重症医学研究所；青岛大学附属青岛第三人民医院 儿科；上海交通大学 生命科学与生物技术学院；江阴建辉生物技术有限公司；上海交通大学药学院 上海儿童医院内分泌科
发表日期：2025-11-07
期刊：BMC Med Genomics. 影响因子 2.9；遗传学 4区；开放获取
DOI: 10.1186/s12920-025-02252-y
研究背景
Von Hippel-Lindau综合征（VHL）是一种常染色体显性遗传病，患者易在多器官（如视网膜、中枢神经系统、肾脏、肾上腺）发生肿瘤或囊肿。该病由VHL 基因的突变引起，突变类型多样，包括：错义、移码、无义、缺失/插入等。
相关检测技术的局限性：① 全外显子测序（WES），在检测小片段拷贝数变异（CNV，<100 kb）时准确性有限。② 基因芯片，对大片段CNV（>1 Mb）检测有效，但对小缺失不敏感。③ 传统MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification, 多重连接依赖性探针扩增)，是检测CNV的“金标准”，但通量低、依赖毛细管电泳，操作复杂。
因此，本研究尝试使用MLPA-NGS（多重连接依赖性探针扩增 结合 二代测序）技术，提高对小片段缺失的检测精度和通量。
研究内容
本研究在一个VHL家系中，先通过WES和基因芯片未能明确检测出VHL基因的缺失，随后采用MLPA-NGS + Sanger测序成功鉴定出一个6,662 bp 的缺失片段，并精确定位其断点位于Alu重复序列内。主要发现：
缺失区域：VHL基因外显子2~外显子3
缺失大小：6,662 bp
断点位置：chr3:10145434 和 chr3:10152097（GRCh38/hg38）
断点位于AluY和AluSx重复序列内
该缺失在ClinVar数据库中为新发现，属于新发变异
研究方法
样本与家系。先证者：29岁女性，14岁确诊视网膜血管瘤；其母亲亦患VHL，其儿子无症状但疑似携带变异。采集先证者、其丈夫及儿子的外周血进行DNA提取。
MLPA-NGS技术流程。探针设计：针对 VHL 基因设计3批探针，逐步增加密度以逼近断点。连接与扩增：使用MLPA试剂盒进行探针杂交、连接、PCR扩增。建库与测序：使用Illumina平台进行测序，读长为40 bp。数据分析：使用Python脚本统计各探针对应读段数。通过内参基因（PKHD1, EYA1等）进行标准化。计算相对拷贝数，判断是否存在缺失。
Sanger测序验证。根据MLPA-NGS结果设计引物，PCR扩增断点区域；通过Sanger测序精确定位断点位置。
生物信息学分析。使用 UCSC Genome Browser 查看重复序列分布；在 ClinVar 数据库中查询是否为已知变异。
图表解读
图1：MLPA-NGS技术流程。探针设计、杂交连接、PCR扩增、NGS测序，结合了MLPA的特异性和NGS的高通量优势。
图2：家系图。显示先证者（III2）及其儿子（IV1）均携带相同VHL缺失。母亲（II3）也患病，符合常染色体显性遗传模式。
图3：基因芯片结果。在VHL基因附近未检测到CNV，说明该缺失片段太小，超出芯片检测范围。
图4：MLPA-NGS分析结果。通过三批探针（灰、绿、红）逐步逼近断点，显示外显子2和3存在杂合缺失。
图5：探针位置与拷贝数示意图展示3批探针在VHL基因上的分布及对应的拷贝数变化，直观呈现缺失区域。
图6：Sanger验证。A：凝胶电泳显示先证者及其儿子出现 <500 bp 条带，丈夫无。B：Sanger测序图谱显示断点连接处。
图7：缺失区域与Alu重复序列的关系。显示缺失片段两端位于 AluY 和 AluSx 重复序列内，提示 Alu 介导的同源重组可能是缺失机制。
研究意义
首次将MLPA-NGS技术用于VHL基因缺失的精确定位，提出“逐步逼近断点”的探针设计策略，提高检测分辨率。为该家系提供明确的分子诊断，可用于遗传咨询和产前诊断。断点定位为未来基因靶向治疗提供可能。此外，再次证实了Alu重复序列在VHL基因缺失中的重要作用，为VHL综合征的基因诊断提供了一种高精度、高通量的新方法。
总之，本研究成功利用MLPA-NGS + Sanger测序，在一个VHL家系中鉴定出一个6,662 bp 的VHL基因缺失，并精确定位其断点。该方法克服了WES、基因芯片在小CNV检测上的局限性，展示了其在遗传病分子诊断中的潜力。研究结果为该家系提供了明确的遗传学诊断依据，也为VHL综合征的机制研究提供了新的数据支持。
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